Nhiều thập kỷ sau cuộc phiêu lưu của phi hành đoàn Enterprise đầu tiên, Thuyền trưởng Jean-Luc Picard chỉ huy tàu Enterprise mới với sứ mệnh khám phá những thế giới mới.

Đặc vụ Bauer làm việc cho tổ chức Counter Terrorist Unit (tạm dịch là Đơn vị chống khủng bố) tại Los Angeles. Bauer là một đặc vụ đầy kinh nghiệm và thành thạo trong cách tiếp cận cũng như tra khảo những đối tượng khủng bố nguy hiểm, nhưng đôi khi những cách này cũng rất tàn bạo. Hầu hết trong suốt cả loạt phim, yếu tố cốt truyện chính diễn ra giống như một bộ phim về chính trị. Còn cốt truyện điển hình trong phim là Bauer luôn phải chạy đua với thời gian trong nỗ lực ngăn chặn nhiều âm mưu khủng bố khác nhau bao gồm: âm mưu ám sát tổng thống, vũ khí hủy diệt hàng loạt, khủng bố bằng vũ khí sinh học, tấn công mạng Internet,... cũng như những âm mưu đối phó với chính phủ và tham nhũng.

Phim xoay quanh nhận vật chính là Sydney Bristow là 1 điệp viên, nội gián của cảnh sát, có nhiệm vụ giả dạng để đột nhập vào các tổ chức mafia trên thế giới. Mỗi tập phim là 1 nhiệm vụ khác nhau của cô và các đồng nghiệp, tuy nhiệm vụ khác nhau nhưng đều có điểm chung đó là rất nguy hiểm, luôn đe dọa tính mạng Sydney và đòi hỏi cô phải hết sức khéo léo, mưu trí để thoát chết và hoàn thành nhiệm vụ.

Trong bộ phim, đặc vụ FBI Fox Mulder (David Duchovny) do muốn tìm lại người em gái mất tích của mình, đã dấn thân vào điều tra tại "X-files" với niềm tin rằng em gái của anh đã bị bắt cóc bởi người ngoài Trái Đất. Mulder rất tin tưởng vào sự tồn tại của người ngoài Trái Đất trong khi người tham gia điều tra cùng Fox Mulder là đặc vụ Dana Scully (Gillian Anderson). Ban đầu, Scully không tin vào những điều mà Fox Mulder nói, nhưng với những bằng chứng cụ thể cùng với những vụ án thực tế cô và Mulder trải qua, dần dần Scully đã tin vào những hiện tượng kỳ bí. Tuy nhiên, tới cuối phim thì nhân vật Fox Mulder xuất hiện ít hơn và có thêm sự xuất hiện của một nhân vật chính khác là đặc vụ John Doggett (Robert Patrick). Tới phiên mình, John Doggett lại nghi ngờ tính xác thực của các vụ án trong X-files và lúc này, chính đặc vụ Scully là người đã khiến cho John Doggett dần dần tin vào X-files

Khi anh trai bị kết án oan vì tội giết người, một kỹ sư kết cấu đã quyết tâm cứu anh mình ra khỏi Nhà tù Liên bang Fox River khét tiếng.

Trong phần hậu truyện này của "Star Trek", chỉ huy Sisko dẫn đầu phi hành đoàn đa chủng tộc thuộc Deep Space Nine, một trạm vũ trụ Liên bang với sứ mệnh phức tạp.